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高效毛细管电泳仪的技术发展皮革篮球

2022-07-22 13:04:58  瑞联机械网

高效毛细管电泳仪的技术发展

高效毛细管电泳仪简称毛细管电泳仪(CE),是以毛细管为分离通道,以高压直流电场为驱动力,利用带电粒子之间的淌度差异和分配系数差异进行分离,是分析科学继高效液相色谱仪之后的又一重大进展,使分析科学从微升级进入到了纳升级水平,不仅使单细胞乃至单分子分析成为可能,也使蛋白质和核酸等生物大分子分析有了新的转机。一、毛细管电泳的发展历史:毛细管电泳是经典电泳技术和现代微柱分离相结合的产物,一出现就引起分离科学界极大的关注。目前,它已成为与20世纪50年代末、60年初出现的气相色谱仪以及20世纪70年代初出现的高效液相色谱仪相媲美的一种分离技术,井被认为是当代分析科学较具活力的前沿研究课题。1937年,发明U形管移动界面电泳仪。这可看作是毛细管电泳发展的开端。1967年,较先在3mm内径的毛细管中作自由溶液的区带电泳。1974年,用200~500μm内径的毛细管作区带电泳分离。早期的研究受当时检测灵敏度的影响,未获得预期的高效分离效率,但为毛细管电泳的发展奠定了基础。1981年,用75μm内径的石英毛细管在3万伏高压下实现40万理论塔板数的空前分离效率,这一工作被认为是现代毛细管电泳发展的里程碑。随后毛细管电泳的研究急速升温,许多大科学家也开始参与研究。1984年,使用含表面活性剂的背景电解质,开辟了毛细管电泳另一个重要分支-毛细管胶束电动色谱。1987年,结合传统的等电聚焦电泳和凝胶电泳原理,实现了毛细管等电聚焦电泳和毛细管凝胶电泳。1988年,实现了微量制备的可能性,提取和分离了50μmol的蛋白质、肽和寡核苷酸等。上世纪80年代末,毛细管电泳的研究非常活跃,90年代起在技术和应用等方面都有了很大发展。1989年,推出第一批高效毛细管电泳仪。1990年,改进和应用了紫外检测器。1992年,激发诱导荧光检测器诞生,毛细管电泳技术得到不断改进和更新,灵敏度和分辨率均达到预期的高效分离效率。二、毛细管电泳分离模式的发展:CE分离模式有毛细管区带电泳(CZE)、毛细管胶束电泳色谱(MECC)、毛细管凝胶电泳(CGE)、毛细管等电聚焦电泳(CIEF)、毛细管等速电泳(CITP)、毛细管阵列电泳(CAE)和毛细管芯片电泳(Chip)等。1、毛细管区带电泳(CZE):CZE又称毛细管自由电泳,由于操作简单、多样化,是目前CE中较基本、应用较广泛的一种分离模式。在CZE中,毛细管内只充入缓冲溶液,在直流高压驱动下.溶质以不同的速度在分立的区带内进行迁移而被分离,由于电渗流的存在,正负离子都可用CZE分离,而中性分子本身在电场中不移动,随电渗流一起流出毛细管。CZE的应用范围很宽,可分离氨基酸、多肽、离子和对映体等。2、毛细管胶束电泳色谱(MECC):在MECC中,把一些离子型表面活性剂(如十二烷基硫酸钠)加到缓冲液中,当其浓度超过临界胶束浓度后,形成有一疏水内核、外部带负电的胶柬。溶质在水相和胶束相(准固定相)之间产生分配,中性粒子因其本身疏水性不同,在两相中分配存在差异而得以分离。MECC使CE能用于中性物质的分离,拓宽了CE的应用范围,是对CE的极大贡献。3、毛细管凝胶电泳(CGE):CGE是将平板上的凝胶移到毛细管中作支持物而进行的电泳,凝胶具有多孔性,起类似分子筛的作用,溶质按分子大小进行分离。凝胶能减小溶质的扩散,峰型尖锐,能达到CE中的较高柱效。常用聚丙烯酰胺在毛细管内交联制成凝胶柱,可分离测定蛋白质和DNA等,但柱制备比较困难,使用寿命短。4、毛细管等电聚焦电泳(CIEF):CIEF是将传统聚焦电泳转移到毛细管中进行,通过管壁涂层使电渗流减小到较小,以防止蛋白质吸附和破坏稳定的聚焦区带。在高压作用下,毛细管内部建立pH梯度,蛋白质在毛细管中向各自的等电点聚焦,形成明显的区带。5、毛细管等速电泳(CITP):CITP是一种较早的分离模式,采用先导电解质和后继电解质,使溶质按其电泳淌度不同得以分离,常用于分离离子型物质。但要采用不连续缓冲液,分辨率差,目前应用不多。6、毛细管阵列电泳(CAE):为了满足大批量样品的分离要求,特别是在人类基因组和蛋白组计划中的应用,CAE渐渐呈现出了广阔的应用发展前景和趋势。与传统聚丙烯酰胺凝胶板电泳可进行多道平行分析相似,CAE是采用多根毛细管组成的阵列进行多道分析。7、毛细管芯片电泳(Chip):当今,分析仪器和分析科学正经历着深刻的变革,其中一个发展趋势就是化学分析仪器的微型化、集成化和便携化,以往一个大实验室的工作量(大量样品、试剂、很多分析和合成时间等),今后将在一块小小的芯片上完成。近年来,毛细管芯片电泳(Chip)的蓬勃发展正是顺应这一趋势。由于CE采用电场驱动,进样能通过电场实现,因此相应的技术和装置比较容易微型化。Chip是以晶体硅、石英玻璃、有机玻璃、陶瓷和硅橡胶为基体材料,采用毛细管电泳技术,将样品进样、分离和检测等过程集成到一起的多功能化的高效、快速、样品用量少的微型实验室技术。Chip与分析仪器的微型化、集成化和便携化紧密相连,符合现代化学、制药工业的低成本和高产出的需求。在电子工业中,芯片一般采用晶体硅,但晶体硅对于Chip并不很合适,因此转而采用石英玻璃、有机玻璃和硅橡胶作为基体材料。不同的材料,其制作方法不同。晶体硅和石英玻璃基体多采用微加工蚀刻法,有机玻璃采用注塑法、印模法和激光烧蚀法。Chip相对于传统CE的主要优点是电渗流泵的扩展应用、良好的散热性能和设计多样性。每一种新兴技术总是在发展的过程中存在着一些问题,有待解决,Chip也是如此。首先,它的芯片材质还在不断的挑选和试用中,每一种材料都有各自的优缺点,需进一步的摸索和完善,尽快找到一些在技术上可行、价格上能接受的材料是当务之急。其次,Chip进样常采用电动进样,但检测器常用LIFD。这样的检测器无法集成到芯片上,使得仅仅是进样和分离集中化,而检测却还是常规尺度,导致芯片虽小,检测器却很大,这显然不符合微型化的要求。因此,也可考虑使用电化学检测器,实现真正的集成化。当然,对于痕量物质的检测十分有效的质谱检测器也是一个方向,同样接口技术还是关键。再次,从单纯、单一的成分分析检测过渡到在线检测、复杂样品前处理和单分子、单细胞分析,也有很多工作要做。另外,市场开发阶段和商品化阶段也是当前所面临的巨大挑战。在产业化的同时,以期带动基础研究,为Chip的进一步发展打下坚实基础。三、毛细管电泳检测技术的发展:CE的毛细管极细,分离效能很高,但同时对样品组分的检测带来了困难,对检测技术的要求较高。如何增加检测器的灵敏度,又不造成明显的区带展宽,一直是CE技术发展中的一个至关重要的问题。迄今为止,已有许多检测技术与CE联用,在不同领域中发挥作用。1、紫外可见光吸收检测:紫外可见光吸收是CE中应用较广泛的一种检测方法。石英毛细管可透过20nm波长以下的紫外光,允许从紫外光到可见光的波长范围内对样品组分进行检测。而且由于透光窗口直接开在毛细管上(柱上检测),检测器本身不存在死体积和因此而造成的组分区带展宽现象。事实上样品组分的分离在检测窗口处仍在进行。为了获得高效,检测区的宽度应小于样品组分的区带宽度,也就是说透光窗口应足够小。毛细管电泳峰宽一般为2~5mm,透光窗口的尺寸应控制在上述峰宽的1/3以内。紫外可见光吸收检测的主要缺点是灵敏度不高,这主要是光程太短所致。2、荧光检测:荧光检测也是CE中一种常见的柱上检测方法,因组分区带小,不会引起额外展宽,而且检测灵敏度很高。尤其是激光诱导荧光检测(LIF),其灵敏度可高达10ˉ12~10ˉ16mol/L,是目前CE中较灵敏的一种检测方法。荧光检测器的缺点是仅能用于有天然荧光和易于用荧光试剂标记或染色的物质的检测,价格较高。但由于LIF的高灵敏度和高选择性,仍是CE中不可缺少的检测方法。3、电化学检测:电化学检测可避免光学类检测器遇到的光程太短的问题,对电活性组分的检测具有灵敏度高、线性范围宽、选择性好和价格低等特点。安培检测是三种电化学检测模式(电导检测、电位检测和安培检测)中较易实现、应用较广的一种检测技术,为微体积环境中电活性物质的测定提供了高灵敏度的检测方法。但安培检测要求被检测物质必须具有良好的电化学活性,因而检测范围有一定的局限性。4、质谱检测:质谱检测(MS)具有较强的定性功能,在一次分析中可获得很多结构信息,将CE与MS相结合是分离科学中的一项突破性进展。(1)CE-MS联用的关键是接口。(2)CE-MS联用有着很强的生命力,但尚存在以下缺点:1)浓度灵敏度低,不如LC-MS。2)不是所有的CE分离模式都可方便地与MS联用。3)MS对CE分离缓冲液的限制较多。(3)CE-MS联用有以下难点需进一步改善:1)如何将被分析物的分子或离子经由CE分离后的液态较终传至高真空的MS中。2)接口处的体积范围怎样才能与CE的峰体积兼容。3)分离电解质的成分怎样才能与质谱的需求兼容。4)在联机模式下如何将CE流出物以在线方式有效地传到MS中而不丢失分离效率。

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